تهیه محیط کشت میکروبی

کشت میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه

انواع میکروارگانیسم ها برای بقاء و ادامه رشد خود مانند تمامی موجودات زنده نیاز به مواد غذایی و فاکتور های محیطی مناسب مانند دما و اتمسفر و pH دارند. در آزمایشگاه برای مطالعه میکروارگانیسم هایی مانند باکتری ها و قارچ ها نیاز به محیط های کشت است. هود لامینار علاوه بر محیط های زیست طبیعی، میکروب ها توانایی زندگی در محیط های مصنوعی و ساخته شده که حاوی مواد غذایی مورد نیاز میکروارگانیسم ها باشد را دارند که به آن محیط کشت می گویند. زمانی که غلظت میکروارگانیسم کم باشد با انجام کشت، تعداد آن ها را می توان افزایش داد. تهیه محیط کشت میکروبی یکی از فرایند های مهم و اولیه در آزمایشگاه های زیستی است.

این مقاله روش تهیه محیط کشت میکروبی را مورد بررسی قرار می دهد.

منظور از محیط کشت میکروبی چیست؟

محیط های کشت آزمایشگاهی در واقع محلول، سوسپانسیون یا مخلوطی حاوی مواد غذایی مورد نیاز برای رشد میکروب ها  و میکروارگانیسم ها هستند.

انواع محیط کشت از نظر فیزیکی

• محیط های کشت جامد آگار
• محیط های کشت نیمه جامد
• محیط کشت مایع

انواع محیط های کشت از نظر نوع مواد تشکیل دهنده و کاربرد آن ها

• محیط کشت پایه (Basic Media):
• محیط کشت غنی شده (Enrichment Media):
• محیط کشت انتخابی (Selective Media)
• محیط کشت افتراقی (Defferential Media)
• محیط کشت اختصاصی (Special Media)
• محیط کشت انتقالی (Transport media)

کشت میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه چه شرایطی نیاز دارد؟

کشت میکروب ها زیر هود لامینار انجام می شود. شرایط کشت برای هر نوع از سلول ها و میکروارگانیسم ها بسیار متفاوت است. اما محیط مصنوعی که در آن سلول‌ها کشت می‌شوند همواره شامل یک ظرف مناسب حاوی بستر یا محیطی است که مواد مغذی ضروری (اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، ویتامین‌ها، مواد معدنی)، فاکتورهای رشد، هورمون ‌ها را تنظیم و  گازها (O₂، CO₂) و محیط فیزیکوشیمیایی (pH، فشار اسمزی، دما) را تنظیم می کند. کشت میکروارگانیسم روی محیط های کشت در انکوباتور انجام می شود.

شرایط محیطی و مواد غذایی برای کشت میکروارگانیسم ها شامل چه مواردی است؟

• منبع کربن: مانند انواع قند هاف اسید های چرب و الکل های مختلف
• منبع نیتروژن: مانند نمک های آمونیوم، پپتون و تریپتون
• ترکیبات نمکی مثل NaCl
• نمک های ایجاد کننده حالت بافری: مانند KH₂PO₄، K₂HPO₄ و Na₂HPO₄
• فاکتور های رشد مانند پورین ها، پیریمیدین ها و ویتامین ها
• معرف های pH که با تغییر رنگ آن ها می توان به اسیدی یا قلیایی بودن محیط پی برد مانند فنل رد در محیط مانیتول سالت آگار

البته الزاما همه موارد فوق در محیط های کشت وجود ندارند و بسته به نوع میکروب ترکیبات موجود در محیط کشت متفاوت هستند.

دستگاه ها و تجهیزات مورد نیاز برای تهیه محیط کشت میکروبی و کشت میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه

• هود لامینار
• انکوباتور
• اتوکلاو
• بن ماری
• سانتریفیوژ
• یخچال آزمایشگاهی
• pH متر
• میکروپیپت
• پلیت
• لوله کشت
• جا لوله ای
• شعله یا هات پلیت
• لوپ یا آنس

روش تهیه محیط های کشت میکروبی

برای تهیه و آماده سازی محیط های کشت روش های مختلفی وجود دارد. برای تهیه محیط های کشت باید بر اساس روش هایی که بر روی ظروف دارای محیط های کشت چاپ شده اند، عمل کرد.

مطابق دستور مندرج روی ظرف حاوی محیط کشت، ابتدا مقدرا معینی از پودر را بردارید، داخل یک بشر یا ارلن بریزد و با آب مخلوط کنید. مخلوط حاصل را روی شعله به مدت چند دقیقه بجوشانید تا کاملا شفاف شود. حین حرارت دادن به خوبی آن را به هم بزنید. در ارلن حاوی محیط کشت را به خوبی ببنید و برای سترون کردن داخل اتوکلاو قرار دهید. پس از پایان اتوکلاو، آن را خارج کرده و تا دمای 45 درجه سانتی گراد خنک کنید. سپس با توجه به حجم پلیت استریل، از محیط کشت داخل آن بریزید. در آن را ببندید تا سرد و جامد شود. پس از سفت شدن، محیط کشت آماده استفاده می شود.

در پتری دیش های با قطر 10 سانتی متر اغلب حدود 10 تا 15 میلی متر از محیط کشت را می ریزند. معمولا برای تهیه محیط کشت در لوله ها در یک لوله آزمایش تا نصف یا یک سوم پر می شود. برای تهیه آگار شیب دار، لوله ها را بعد از ریختن محیط مورد نظر به شکل مایل و مورب نگه داشته تا خودش را گرفته و سفت شود.

روش تهیه محیط کشت نوترین آگار (N.A.)

این محیط دارای اکثر مواد مغذی و لازم برای رشد بیشتر باکتری ها است.

1. 23 گرم از پودر آماده را در 1000 میلی لیتر آب حل کنید.
2. مایع حاصل را چند دقیقه بجوشانید تا رنگ محیط شفاف شود. در صورت استفاده از شعله مستقیم به جای هات پلیت، باید محیط را به طور مرتب هم زد تا آگار نسوزد و به اصطلاح ته نگیرد.
3. مایع به دست آمده را به وسیله اتوکلاو استریل کنید.
4. محیط تهیه شده را در پلیت ها تقسیم کنید.

روش تهیه محیط کشت S.I.M

کاربرد این محیط کشت در بررسی حرکت باکتری ها و قدرت تجزیه و آزاد سازی گوگرد به وسیه باکتری مورد نظر است.

1. مقدار مشخص ذکر شده روی بسته بندی پودر را وزن کنید و داخل 1000 میلی لیتر آب حل کنید.
2. سایر مراحل مشابه روش تهیه محیط نوترین آگار است.

روش تهیه محیط کشت ائوزین متیلن بلو (E.M.B.)

این محیط دارای لاکتوز و معرف شیمیایی ائوزین متیلن بلو (جهت جلوگیری از رشد باکتری های گرم مثبت) است. به همین جهت باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر می کنند در این محیط به رنگ قرمز تا سیاه ظاهر می شوند و باکتری های گرم منفی که لاکتوز را تخمیر نمی کنند کلنی هایی به رنگ محیط به وجود می آورند. مثلا اشریشیا کلی در این محیط کلنی سیاه رنگ تولید می کند و روی پلیت سایه ای از رنگ سبز متالیک (جلای سبز رنگ) دیده می شود .

روش تهیه این محیط کشت مشابه موارد قبلی است.

روش تهیه محیط کشت خون دار

محیط کشت آگار خون دار یکی از محیط های کشت مغذی است که شرایط رشد بسیاری از باکتری ها را فراهم می کند.

1. ابتدا بر اساس روشی که گفته شد، محیط نوترین آگار را تهیه کنید.
2. 2.    5 درصد از خون مورد نظر را به محیط بیافزایید. دمای محیط نوترین آگار باید در حدود 45 تا 50 درجه سانتی گراد باشد.
3. مخلوط را تکان دهید تا کاملا یکنواخت و حل شود.
4. سپس محیط را در پلیت ها تقسیم کنید و استریل سازی را انجام دهید.

روش تهیه محیط کشت قندی

برای تهیه این نوع محیط کشت به پایه با فنیل رد نیاز است. پس از تهیه محیط Phenol red Broth Base، از هر کدام از قند های مورد نیاز 0.5 تا 1 درصد به محیط اضافه کنید. سپس لوله های ازمایش را اتوکلاو استریل کنید.