تعیین نقطه ایزوالکتریک پروتئین ها

مفاهیم نقطه ایزوالکتریک پروتئین

پروتئین ها دارای گروه های قابل یونیزاسیون مانند گروه های کربوکسیل و گروه های آمینه می باشند. ساخت و نصب سکوبندی ازمایشگاهی به بیان ساده تر پروتئین ها در محلول می توانند دارای بار مثبت و منفی باشند. پروتئین ها با توجه به ویژگی های محیط اطراف قابلیت تبدیل شدن به یون دو قطبی یا زوییتر یون (Zwitterion) را دارند. واضح است که یون دو قطبی ها از نظر الکتریکی خنثی هستند. با این تعریف خواص پروتئین ها از نظر الکترولیتی به تعداد گروه هایی که قابلیت یونیزه شدن دارند، وابسته است. از طرف دیگر بار گروه های پروتئین به pH محیط اطراف پروتئین بستگی دارد. یک مولکول پروتئین می تواند بار های متفاوتی در pH های مختلف داشته باشد. نقطه ایزوالکتریک پروتئین در واقع به پی اچی گفته می شود که در آن پروتئین بار خالص ندارد.

تعریف نقطه ایزوالکتریک پروتئین و کاربرد های آن

نقطه ایزوالکتریک پروتئین (pI) به عنوان pH تعریف می شود که در آن بار خالص یک مولکول پروتئین صفر است. بر این اساس، پروتئین ها در pH کمتر از pI خود دارای بار مثبت و در pH بالاتر از pI خود دارای بار منفی هستند. نقطه ایزوالکتریک پروتئین معیاری از تفوت های شیمیایی هر پروتئین است و برای محققان کاربرد های مختلفی دارد. از pI  برای تمایز بین پروتئین‌ ها در روش ‌های جداسازی، خالص‌سازی، تبلور و غیره استفاده می‌شود.

مزایای دانستن نقطه ایزوالکتریک پروتئین

• نقطه ایزوالکتریک پروتئین در خالص سازی پروتئین مهم است. زیرا نشان دهنده pH است که در آن حلالیت معمولاً حداقل است.
• pI در درک برهمکنش های آنزیم-سوبسترا مهم است. یک آنزیم و بستر آن نباید هر دو بار مثبت یا هر دو بار منفی داشته باشند. زیرا در این صورت این دو یکدیگر را دفع می کنند. لذا برای این که بدانیم آیا آنزیم دارای بار مثبت یا بار منفی در pH محیط معین است، باید pI پروتئین را بدانیم. اگر pI آن بیشتر از pH باشد دارای بار مثبت و اگر pI آن کوچکتر از pH باشد دارای بار منفی است.
• پایداری یک پروتئین اغلب به برهمکنش الکترواستاتیکی بین گروه‌ های دارای بار مثبت و بار منفی آن روی سطح پروتئین در شرایط فیزیولوژیکی آن بستگی دارد. هنگامی که pH به طور قابل ملاحظه ای از pH فیزیولوژیکی منحرف می شود، برهمکنش الکترواستاتیکی مختل می شود و پروتئین دناتوره می شود. به عنوان مثال، در pH اسیدی، گروه کربوکسیل پروتونه می شود و بارهای منفی کاهش می یابد، در حالی که بیشتر گروه های آمینه بار مثبت دارند. چنین پروتئینی تمایل به از دست دادن ثبات خود، کمتر فشرده شدن و در نهایت دناتوره شدن دارد.
• جداسازی پروتئین ها به وسیله نقطه ایزوالکتریک پروتئین بخش مهمی از الکتروفورز ژل دو بعدی پروتئین است. در منحنی تیتراسیون، نقطه ایزوالکتریک (pI) مقداری است که در آن بار خالص سطحی یک گونه پلی پروتیک ماکرومولکولی برابر با صفر است.

نحوه اندازه گیری نقطه ایزوالکتریک پروتئین کازئین

در این قسمت به عنوان مثال روش اندازه گیری نقطه ایزوالکتریک کازئین که پروتئین موجود در شیر است را بررسی می کنیم. این آزمایش را با تغییرات جزئی می توان برای محاسبه نقطه ایزوالکتریک سایر پروتئین ها نیز تعمیم داد.

با استفاده از قابلیت انحلال پذیری پروتئین می توانیم نقطه ایزوالکتریک پروتئین را در pH های مختلف تعیین کنیم. تنها با داشتن pH متر دقیق در آزمایشگاه می توانید این مقدار را اندازه گیری کنید.

به منظور تعیین نقطه ایزوالکتریک پروتئین کازئین، 7 لوله آزمایش برداشته و مقادیری از اسید استیک و استات سدیم را به میزانی که در جدول ذکر شده به لوله های آزمایش اضافه کنید. پس از اضافه کردن استیک اسید و استات سدیم به هر لوله بافری با pH مشخص تولید می شود. سپس می توانید pH هر محلول را با استفاده از pH متر اندازه گیری کنید.